免疫組化：

是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

實驗流程：

切片—脫蠟至水—抗原修復—滅活—封閉—一抗孵育—二抗孵育—顯色—復染—封片

1， 切片：切片厚度4微米，42°C水溫展片，60°C烘箱烤片30分鐘。   注意：對于骨或皮膚易脫片的組織，可適當延長烤片時間。

2， 脫蠟至水：二甲苯Ⅰ5分鐘，二甲苯Ⅱ5分鐘，二甲苯Ⅲ5分鐘，無水乙醇1分鐘，95%乙醇1分鐘，75%乙醇1分鐘，蒸餾水洗5分鐘。   注意：具體時間需要根據室溫盒二甲苯的新舊程度靈活調整，室溫越高，二甲苯越新，相應時間越短，以組織上無狀石蠟殘留為準。

3， 抗原修復：EDTA微波熱修復5-8分鐘，冷卻至室溫。      注意 ：對于大部分蛋白來說，EDTA修復液一般都能得到滿意的結果，也可使用胰酶法修復液或傳統的檸檬酸鹽修復液，樣本固定時間過久或者陽性表達不強，可適當增加修復的次數和強度。

4，  滅活：免疫組化筆畫圈，防止試劑流出，滴加內源性過氧化物酶阻斷液，室溫孵育10分鐘，PBS緩沖液洗3次，每次5分鐘。     注意：對于內源性過氧化物酶含量高的組織，可以適當延長孵育時間或增加過氧化氫濃度。

5， 封閉：滴加封閉血清37℃孵育30分鐘，甩去多余血清，勿洗。

6， 一抗孵育：滴加一抗，37℃濕盒孵育2h，PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘。      注意：初次實驗，建議一抗做濃度梯度，以確定最佳的一抗稀釋比例。

7， 二抗孵育：滴加HRP標記羊抗兔，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液清洗3次，每次5分鐘。      注意：根據一抗種屬決定二抗的類型，比如一抗為兔抗，那二抗選擇HRP標記的羊抗兔lgG。

8， 顯色：DAB顯色液，配置DAB：1mlB液+1滴A液混勻，滴加DAB顯色液，鏡下觀察至陽性明顯增強、背景干凈終止顯色；如果顯色淡，可重復上一步增強顯示色。

9， 復染：滴加Mayer?S蘇木素30s，蒸餾水洗，返藍液漫泡1分鐘，水洗。

    10，脫水透明封片：75%-95%-100%酒精梯度脫水，每缸1分鐘，二甲苯透明三缸，每缸2分鐘，中性樹膠封片。

    結果：陽性部位棕褐色，細胞核天藍色，對比鮮明，無背景著色。