一、免疫熒光（單標）

免疫熒光單標標記即利用抗原抗體特異性結合原理，在一張切片上的一個抗原進行熒光標記，從而實現定位，定性，半定量的分析。

實驗流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。  

2、抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH8.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定)。

3、畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)。

4、血清封閉:在圈內滴加BSA孵育30min（一抗若是山羊來源，則加兔血清）。

5、加第一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)

6、加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬標記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

9、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像或熒光顯微鏡下拍照。(DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光;FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光;CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光，綠光 。

二、免疫熒光（雙標）

　免疫熒光雙重標記即利用抗原抗體特異性結合原理，在同一張切片上兩個抗原進行同時標記，從而實現定位，定性，半定量的分析。1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH8.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定)。

3、畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)。

4、血清封閉:在圈內滴加BSA孵育30min。(一抗若是山羊來源，則加兔血清)。

5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，兩種一抗按一定的稀釋比例混合，滴加到組織上，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)。

6、加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬標記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。(兩種二抗，按照一定的比例混合孵育)。

7、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

9、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。(DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光;FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光;CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光，綠光 。